A liberação de CXCL10/IP-10 é induzida pela incubação de sangue total de pacientes com tuberculose com ESAT-6, CFP10 e TB7.7
As respostas de IFN-γ a antígenos específicos do Mycobacterium tuberculosis são usadas como testes de diagnóstico in vitro para a infecção por tuberculose. Esses testes são sensíveis e específicos para a doença latente e ativa, mas a sensibilidade pode ser reduzida durante a imunossupressão. O objetivo do estudo foi explorar novas maneiras de melhorar o diagnóstico da infecção por tuberculose usando CXCL10 e IL-2 como marcadores alternativos ao IFN-γ.
As respostas de CXCL10, IL-2 e IFN-γ após a estimulação com ESAT-6/CFP10/TB7.7 foram avaliadas em 12 pacientes com tuberculose positivos para o teste Quantiferon, 8 pacientes negativos e 11 controles saudáveis. CXCL10 e IL-2 foram medidos por multiplex e IFN-γ pelo ensaio Quantiferon ELISA. A resposta mediana de CXCL10 em pacientes com tuberculose foi de 870 pg/ml (intervalo: 261-1576 pg/ml), significativamente maior que a de outros citocinas (p = 0.001). Em 4 dos 7 indivíduos com teste Quantiferon negativo ou indeterminado, respostas elevadas de CXCL10 foram detectadas (196-532 pg/ml). Os achados sugerem que CXCL10 pode ser um marcador alternativo ou adicional para o diagnóstico imunológico da tuberculose.
Fig. 1. Produção de IFN-γ, CXCL10 e IL-2 específicos para antígenos.
O sangue total de 12 pacientes com tuberculose positivos no teste Quantiferon in tube e 11 indivíduos saudáveis não expostos foi estimulado por 20 a 24 horas com solução salina ou antígenos específicos do M. tuberculosis. A produção de citocinas foi medida no sobrenadante do plasma por ELISA (IFN-γ) e tecnologia multiplex (CXCL10, IFN-γ e IL-2). A produção específica do antígeno representa a amostra estimulada pelo antígeno subtraída da amostra não estimulada. As linhas retas representam os valores medianos. As diferenças entre os controles saudáveis e os pacientes foram todas significativas (p < 0,0001; Kruskal-Wallis). A diferença entre os níveis de CXCL10 e IFN-γ (ELISA) entre os pacientes foi significativa (870 pg/ml versus 217 pg/ml, p = 0,001; teste de postos sinalizados de Wilcoxon).
1. Introdução Os testes imunodiagnósticos para tuberculose (TB) incluem o Quantiferon® TB Gold e T-SPOT TB ELISPOT®, que medem a liberação de IFN-γ por células T sensibilizadas após estimulação com ESAT-6, CFP-10 e TB7.7. Estes testes são mais precisos que o teste tuberculínico, mas há preocupações sobre sua sensibilidade em grupos de risco, como imunossuprimidos. O presente estudo explora o uso de CXCL10 e IL-2 como biomarcadores alternativos ao IFN-γ.
CXCL10 (às vezes chamado de IP-10) é uma quimiocina envolvida na resposta imune mediada por células Th1, e tem sido encontrada em níveis elevados em granulomas tuberculosos e no plasma de pacientes com TB. IL-2, por sua vez, é essencial para a proliferação de células T e também pode estar envolvida na resposta à TB.
2. Materiais e Métodos
2.1 População do estudo Foram incluídos pacientes de Guine-Bissau e Dinamarca, divididos em três grupos:
- 12 pacientes com TB ativa e teste Quantiferon positivo.
- 7 pacientes com TB ativa e teste Quantiferon negativo ou indeterminado.
- 11 controles saudáveis. A aprovação do estudo foi concedida pelos comitês éticos de Copenhague e Guine-Bissau.
2.2 Estimulação de sangue total O sangue foi coletado e incubado com antígenos ESAT-6, CFP-10, TB7.7, mitógeno (PHA) ou solução salina (controle negativo) por 20-24 horas a 37°C.
2.3 Determinação de IFN-γ por ELISA A quantidade de IFN-γ foi medida por ELISA comercial, sendo considerada positiva uma resposta ≥17,5 pg/ml.
2.4 Determinação de citocinas por multiplex Usando a tecnologia xMAP no sistema Luminex, foram quantificadas CXCL10, IL-2 e IFN-γ. Os resultados foram analisados usando software STarStation v2.0.
3. Resultados
3.1 Medidas de citocinas CXCL10 foi significativamente induzido em pacientes com TB, enquanto IL-2 e IFN-γ também diferiram entre pacientes e controles. A liberação espontânea de CXCL10 foi 5,6 vezes maior nos pacientes com TB.
3.2 Concordância entre medições de IFN-γ por multiplex e ELISA Houve forte correlação entre ambos os métodos (r = 0.75; p < 0.0001), embora o ELISA tenha produzido valores mais altos.
3.3 Potencial diagnóstico de CXCL10 e IL-2 CXCL10 mostrou-se superior a IFN-γ no grupo com TB ativa e negativo para Quantiferon. A diferença entre pacientes e controles foi altamente significativa (p < 0.0001).
3.4 Melhorando o diagnóstico em pacientes com TB e teste Quantiferon negativo Dos 7 pacientes com TB e teste Quantiferon negativo ou indeterminado, 4 apresentaram respostas significativas de CXCL10, sugerindo maior sensibilidade.
4. Discussão O estudo demonstra que CXCL10 pode ser um biomarcador promissor para TB. Ele pode superar o IFN-γ na detecção de infecções latentes e ativas, especialmente em pacientes imunossuprimidos. Além disso, a dosagem de CXCL10 pode ser adaptada para testes de campo de fácil execução.
5. Conclusão CXCL10 é um potencial novo marcador para a infecção por M. tuberculosis, sendo possivelmente mais sensível que IFN-γ. Estudos adicionais devem padronizar a metodologia e avaliar sua utilidade em diferentes populações.
Agradecimentos Agradecimentos aos pacientes, equipe do estudo e financiadores, incluindo a Sociedade Dinamarquesa de Doenças Infecciosas e a Universidade de Copenhague.
Autores: Morten Ruhwald, Morten Bjerregaard-Andersen, Paulo Rabna, Kristian Kofoed, Jesper Eugen-Olsen, Pernille Ravn
Instituições:
- Departamento de Doenças Infecciosas, Hospital Universitário de Copenhague, Dinamarca
- Unidade de Pesquisa Clínica, Hospital Universitário de Copenhague, Dinamarca
- Departamento de Doenças Infecciosas, Hospital Universitário de Skejby, Dinamarca
- Projeto de Saúde de Bandim, Guine-Bissau
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